Formulação de Cloreto de Cálcio a 10%

Introdução

O cloreto de cálcio (CaCl₂) é um sal de cálcio simples e altamente solúvel, amplamente utilizado na medicina, química e biologia. Na terapia com PRP, uma solução de cloreto de cálcio a 10% é um ativador de plaquetas clinicamente validado, desencadeando a liberação de fatores de crescimento ao iniciar a cascata de coagulação. Embora o gluconato de cálcio seja preferido para uso intraarticular, o Soro Autólogo de Trombina (ATS) é o ativador superior para aplicações de PRP intramuscular e em tendões — e o cloreto de cálcio é o reagente essencial utilizado para produzi-lo.

O cloreto de cálcio desempenha um papel central na preparação do ATS a partir do Plasma Pobre em Plaquetas (PPP) previamente isolado, atuando como um coagulante para induzir a formação de coágulo. Esse processo de coagulação permite a coleta de um soro rico em trombina, que pode ser utilizado para ativar fortemente o LR-PRP antes da aplicação. Essa aplicação é o foco principal do uso do cloreto de cálcio dentro do sistema DIYPRP.

Por que é usado no PRP?

O cloreto de cálcio desempenha dois papéis fundamentais nos fluxos de trabalho da terapia regenerativa:

1. Ativação Direta das Plaquetas: Quando o cloreto de cálcio é adicionado ao PRP, ele reintroduz íons de cálcio livres em um sistema previamente anticoagulado com agentes como o ACD-A. Isso restaura as condições iônicas fisiológicas e desencadeia a cascata de coagulação. O resultado é uma ativação controlada das plaquetas, levando à liberação de grânulos alfa contendo PDGF, TGF-β, VEGF e outros fatores de crescimento. Forma-se uma leve rede de fibrina, ajudando na retenção desses fatores no local.
2. Preparação do Soro Autólogo de Trombina (ATS): Quando o cloreto de cálcio é adicionado ao Plasma Pobre em Plaquetas (PPP), ele promove a coagulação e a formação de coágulo. Durante esse processo de coagulação, a protrombina presente no plasma é convertida em trombina, que pode ser colhida no sobrenadante como Soro Autólogo de Trombina. O ATS é um ativador potente, utilizado especialmente em protocolos de PRP rico em leucócitos (LR-PRP) para lesões musculares ou tendíneas, proporcionando liberação rápida de fatores de crescimento e formação robusta de matriz de fibrina.

Para a preparação do ATS, quantidades específicas de plasma pobre em plaquetas (PPP) e solução de cloreto de cálcio a 10% são misturadas mantendo uma proporção de 1:10 de CaCl₂ para PPP. A mistura é então deixada em repouso por um curto período e, em seguida, centrifugada para isolar o soro rico em trombina. Esse soro resultante pode ser coletado do sobrenadante para uso imediato como ativador em preparações de LR-PRP.

Essa dupla utilidade — tanto como ativador direto de plaquetas quanto como agente coagulante para gerar ATS — torna o cloreto de cálcio exclusivamente versátil no fluxo de trabalho do PRP.

Uso Prático

O cloreto de cálcio é mais adequado para as seguintes funções:

• Criação de Soro Autólogo de Trombina a partir de PPP para uso posterior em ativações de LR-PRP.
• Géis tópicos ricos em fibrina onde a coagulação é desejável para adesão em feridas.
• Ativação de PRP em ambientes de pesquisa controlados, onde a degranulação rápida é desejada.

Não é a escolha ideal para infiltrações intra-articulares (IA). Para aplicações intra-articulares, o gluconato de cálcio é mais adequado devido à sua cinética de liberação mais lenta, que se alinha melhor com os prazos de reparo biológico dos tecidos articulares com baixa vascularização.

A criação de soro de trombina usando cloreto de cálcio é um processo mais complexo, mas resulta em uma ativação plaquetária mais robusta e sustentada por fibrina, ideal para terapias com PRP em aplicações intramusculares ou tendíneas.

Nota: Se ACD-A foi utilizado como anticoagulante durante a preparação do PRP, a dosagem de cloreto de cálcio deve ser cuidadosamente calculada para garantir que haja cálcio livre suficiente para superar a ligação com o citrato. Cálcio insuficiente resultará em ativação incompleta ou formação tardia do coágulo.

Formulação de Solução de Cloreto de Cálcio a 10%

LEIA ANTES DE CONTINUAR: Certifique-se de que toda a vidraria e ferramentas de aço inoxidável utilizadas, incluindo béqueres de vidro, colheres de medição, copos de balança ou qualquer outro item que entre em contato com qualquer substância química ou produto, estejam despirogenizados de acordo com nosso protocolo de Despirogenização e Esterilização Avançada.

Formular uma solução de cloreto de cálcio a 10% é um processo direto, porém quimicamente sensível, que exige medição precisa e técnica estéril. Qualquer pessoa que pretenda formular cloreto de cálcio para uso em sistemas de PRP, especialmente quando utilizado para gerar soro autólogo de trombina, deve possuir conhecimento prático em segurança laboratorial e procedimentos de manuseio. Este guia não aborda princípios básicos de higiene química ou práticas laboratoriais estéreis, que são essenciais para evitar contaminações.

Todo o material de vidro utilizado na preparação de soluções de cloreto de cálcio, especialmente para uso clínico ou regenerativo, deve passar por despirogenização por calor seco a 250 °C por pelo menos 30 minutos para eliminar endotoxinas. A técnica estéril deve ser mantida durante todo o processo, e a filtração por um filtro estéril de 0,22 µm é obrigatória para reduzir o risco microbiano.

Concentração Final:

• 10% (p/v) = 100 g/L

Nota: Se estiver utilizando CaCl₂ anidro, a concentração equivalente para 10% p/v é aproximadamente 73 g/L.

Materiais e Equipamentos Necessários

1. Luvas Estéreis
   • Uso: Luvas estéreis para manuseio de componentes estéreis.
2. Máscara cirúrgica
   • Uso: Mantenha a esterilidade do ambiente de trabalho.
3. Seringa Luer Lock de 20 mL
   • Uso: Preparar a solução de cloreto de cálcio misturando com água estéril.
4. Agulha 25 x 0,70 mm (22G x 1)
   • Uso: Extrair água estéril de ampolas.
5. Tiras de Teste de pH
   • Uso: Verificar o nível de pH da solução de cloreto de cálcio preparada.
6. Copo de Vidro de 50 mL
   • Uso: Misturar todos os componentes constituintes.
7. Colher de Chá
   • Uso: Transferir produtos químicos.
8. Balança Analítica
   • Uso: Pesar todos os componentes constituintes.
   • Nota: Requer precisão de 0,001 gramas.
9. Cloreto de Cálcio Dihidratado Grau USP (CaCl₂·2H₂O)
   • Uso: Componente ativo
10. 40 mL de Água Estéril para Injeção
    • Uso: Preparando a solução de cloreto de cálcio e preparando o filtro de seringa.
11. Bastão de Vidro
    • Uso: Mexendo o conteúdo no béquer até obter uma mistura homogênea.
12. Filtro de Seringa Estéril de 30 mm, Membrana PES, 0,22 Microns
    • Uso: Filtrando e esterilizando a solução de cloreto de cálcio antes de transferi-la para o frasco estéril de 30 mL.
    • Nota: Um filtro de 0,22 µm é suficiente para remover bactérias e partículas, mas não elimina citotoxinas, endotoxinas ou pirógenos. Para aplicações in vivo, uma membrana de polietersulfona (PES) é normalmente utilizada devido à sua biocompatibilidade e baixa afinidade por proteínas. Vidrarias e reagentes devem estar estéreis.
13. Agulha 25 x 0,70 mm (22G x 1)
    • Uso: Preenchendo o frasco de cloreto de cálcio com a solução de cloreto de cálcio esterilizada.
14. Lenço Estéril
    • Uso: Limpando o septo de borracha do frasco de cloreto de cálcio antes de adicionar a solução.
15. Frasco de Armazenamento de Cloreto de Cálcio, 30 mL
    • Uso: Armazenando a solução de cloreto de cálcio a 10%.
    • Nota: O frasco deve estar esterilizado e livre de citotoxinas, endotoxinas e pirógenos. Utilize técnicas adequadas de esterilização.

Instruções:

Nota: Todo o material de vidro utilizado deve ser devidamente esterilizado previamente por meio de depirossinização por calor seco a 250°C durante trinta minutos antes do uso.

1. Pese 3.0 grams de Calcium Chloride Dihydrate, e adicione ao copo de vidro.
2. Prepare a seringa de 20 mL acionando o êmbolo algumas vezes. Isso ajudará a soltar o êmbolo.
3. Use a agulha 22G para retirar 30 mL de água estéril das ampolas e adicione essa água ao copo de vidro.
   • Nota: Água estéril é preferida, pois está livre de citotoxinas, endotoxinas e pirógenos que poderiam causar uma reação adversa em aplicações in vivo.
4. Após adicionar a água, mexa bem a mistura até obter uma solução homogênea. Alguns cristais permanecerão no fundo e podem ser esmagados com a extremidade da haste de vidro.
   • Nota: Essa mistura gera uma reação levemente exotérmica e a solução aquecerá.
5. Use um medidor de pH para verificar o pH da solução. O pH esperado de uma solução recém-preparada de CaCl₂ a 10% (p/v) geralmente varia de 5,5 a 7,5. O ideal é cerca de 6,0.
   • Nota: Pingue uma pequena quantidade da solução sobre a fita de teste em vez de mergulhá-la diretamente na solução, para evitar contaminação.
6. Use o lenço estéril para higienizar o tampão de borracha do frasco de armazenamento de 30 mL.
7. Prepare o filtro de seringa anexando-o a uma agulha estéril 22G, tendo cuidado para não contaminar o lado estéril do filtro.
8. Usando a ampola restante de 10 mL de água estéril, puxe a água para dentro de uma seringa de 20 mL. Use essa água para preparar o filtro estéril empurrando-a através do filtro para um recipiente de descarte. Este passo garante que quaisquer fibras soltas ou partículas no lado estéril do filtro sejam eliminadas e não contaminem a solução final.
9. Tampe a montagem da agulha/filtro estéril e desconecte da seringa. Reserve.
10. Usando a seringa de 20 mL, aspire a solução de cloreto de cálcio a 10% do béquer. Observe que 10 mL da solução permanecerão no béquer e precisarão ser processados em uma etapa subsequente.
11. Conecte o conjunto de agulha/filtro estéril à seringa de 20 mL e prossiga para encher o frasco de 30 mL com a solução de cloreto de cálcio a 10%.
12. Uma vez que a seringa de 20 mL esteja vazia, desconecte a seringa da montagem da agulha/filtro, deixando a montagem no tampão de borracha do frasco.
13. Aspire o restante da solução de cloreto de cálcio a 10% do béquer utilizando a seringa. Reencaixe a seringa no conjunto de agulha/filtro sem removê-lo do septo de borracha, e complete o enchimento do frasco com o restante da solução.
14. Certifique-se de que a solução no frasco esteja límpida e livre de partículas.
15. Limpe o frasco e rotule-o com o conteúdo e a data de formulação.

Armazenamento e Validade

• Armazene em um frasco de vidro estéril e hermético ou em um recipiente de polipropileno
• Mantenha em temperatura ambiente (15–25°C)
• Proteja da umidade — o cloreto de cálcio é altamente higroscópico
• Utilize em até 30 dias

Posso Usar Cloreto de Cálcio Grau P.A.?

Para uso tópico ou ex vivo, você pode preparar uma solução de 10% de CaCl₂ a partir do pó grau P.A. (analítico), se:

• Utilizar água destilada ou grau WFI
• Filtrar a solução final por um filtro estéril de 0,22 µm
• Realizar despirogenização por calor seco aquecendo todo o material de vidro a 250°C por mais de 30 minutos para eliminar endotoxinas dry heat depyrogenation by baking all glassware at 250°C for 30+ minutes to destroy endotoxins

No entanto, cloreto de cálcio grau USP é fortemente recomendado em vez do grau P.A. para qualquer preparação destinada à injeção em humanos.

Orientação DIYPRP

No sistema DIYPRP, a solução de cloreto de cálcio a 10% é usada principalmente para gerar Soro Autólogo com Trombina (ATS) a partir de PPP previamente isolado. Esse soro pode então ser utilizado para ativar fortemente preparações de PRP rico em leucócitos (LR-PRP) voltadas para aplicações intramusculares ou em tendões. Ele oferece uma ativação superior em comparação com o uso de cálcio isolado, embora exija mais tempo de preparo.

Para aplicações intra-articulares de PRP, o ativador preferido é o gluconato de cálcio, que proporciona um perfil de ativação mais lento e sustentado, adequado ao ambiente de baixa vascularização das articulações.

Observações sobre a Interação com ACD-A

Se você utilizar o anticoagulante ACD-A, lembre-se de que ele quelata o cálcio livre. O cloreto de cálcio adicionado deve superar a capacidade de ligação do citrato para que as plaquetas sejam ativadas. Por isso, o tempo e a dosagem são cruciais: a mistura deve ser feita imediatamente antes da injeção ou da formação do coágulo, para evitar ativação prematura ou falha na ativação.

Referências

1. Everts, P. A., et al. (2006). “Platelet-rich plasma and platelet gel: a review.” Journal of Extra-Corporeal Technology, 38(2), 174–187.
   - Analisa os mecanismos de ativação plaquetária, incluindo a desgranulação induzida por cloreto de cálcio e o início da cascata de coagulação.
2. Mishra, A., et al. (2014). “Platelet-rich plasma in orthopedic applications: evidence-based recommendations for treatment.” Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, 22(18), 469–470.
   - Apresenta recomendações baseadas em evidências para o uso de PRP em lesões musculares e tendíneas, destacando a importância da ativação controlada.
3. Xie, X., et al. (2014). “Comparison of different platelet-rich plasma formulations in the treatment of knee osteoarthritis: a randomized clinical trial.” American Journal of Sports Medicine, 42(8), 1952–1960.
   – Compara os resultados de diferentes estratégias de ativação de PRP em osteoartrite de joelho.
4. Anitua, E., et al. (2004). “Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration.” Thrombosis and Haemostasis, 91(1), 4–15.
   – Descreve a liberação gradual de fatores de crescimento e o uso de CaCl₂ na ativação plaquetária.
5. Marx, R. E. (2004). “Platelet-rich plasma: evidence to support its use.” Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 62(4), 489–496.
   – Apoia o uso clínico de cloreto de cálcio na criação de trombina autóloga e na adesão tecidual.
6. Sundman, E. A., et al. (2011). “The anti-inflammatory and matrix restorative mechanisms of platelet-rich plasma in osteoarthritis.” American Journal of Sports Medicine, 39(11), 2362–2369.
   – Destaca a relevância da ativação retardada para PRP intra-articular e o efeito da densidade de fibrina.
7. Drago, L., et al. (2013). “Platelet-rich plasma for the treatment of orthopedic infections: an in vitro study.” PLoS ONE, 8(9), e73863.
   – Demonstra a compatibilidade do cloreto de cálcio com preparações estéreis e injetáveis.
8. Takikawa, M., et al. (2011). “Enhanced effect of platelet-rich plasma containing a new carrier on hair growth.” Dermatologic Surgery, 37(12), 1721–1729.
   – Explica a geração de trombina induzida por cloreto de cálcio em PPP para produção de soro enriquecido.
9. Blajchman, M. A. (1997). “Immunomodulation and blood transfusion.” American Journal of Therapeutics, 4(5-6), 343–348.
   – Fornece considerações de segurança sobre armazenamento e preparo, incluindo esterilidade e controle de pirógenos.