Preparação de Soro Autólogo de Trombina (ATS) para Ativação Plaquetária

Preparando Soro Autólogo de Trombina a partir de PPP Pré-Isolado para Ativação de 5 mL de PRP
Objetivo: Produzir aproximadamente 0,5 mL de soro autólogo de trombina (ATS) para ativar 5,0 mL de PRP.

Para instruções sobre como formular uma solução de cloreto de cálcio a 10% (necessária para produzir ATS), consulte previamente o nosso guia de formulação.

Introdução

O Soro Autólogo de Trombina (ATS) é um reagente potente derivado do próprio paciente, criado ao induzir a coagulação no plasma pobre em plaquetas (PPP). O soro resultante é rico em trombina — uma enzima-chave na cascata de coagulação — que atua como um ativador potente das plaquetas. Quando misturado com PRP rico em leucócitos (LR-PRP), o ATS provoca uma degranulação rápida e completa das plaquetas, resultando na liberação máxima de fatores de crescimento e na formação de uma matriz de fibrina robusta. Isso o torna particularmente ideal para aplicações musculoesqueléticas, como injeções intramusculares ou tendíneas, onde são desejados forte adesão tecidual e sinalização regenerativa rápida.

Embora ativadores químicos como o cloreto de cálcio possam ser usados diretamente para iniciar a coagulação, o ATS oferece uma ativação biológica mais robusta ao imitar a ação fisiológica da trombina. Essa abordagem proporciona um controle aprimorado sobre a formação do coágulo e a cinética de liberação dos fatores de crescimento, algo especialmente crítico em ambientes dinâmicos e de alta carga, como tendões e músculos.

Por que e como o ATS é utilizado na terapia com PRP

O ATS é normalmente utilizado para ativar o LR-PRP antes da injeção em tecidos moles, como músculos ou tendões. A trombina presente desencadeia uma cascata de ativação plaquetária quase instantânea, garantindo a desgranulação completa das plaquetas e a formação de uma matriz de fibrina densa no local de aplicação. Esse perfil de ativação rápida é especialmente benéfico quando há forças mecânicas elevadas, como em lesões do manguito rotador, rupturas de isquiotibiais ou tendinopatia de Aquiles.

Em comparação com a ativação direta por cloreto de cálcio, que depende de vias iônicas mais lentas e da geração gradual de fibrina, o ATS proporciona uma coagulação mais rápida, intensa e localizada, promovendo adesão tecidual e uma alta concentração local de fatores tróficos. Embora exija mais etapas de preparo, seus efeitos são clinicamente superiores em muitos procedimentos ortopédicos e de medicina esportiva.

Vantagens de Segurança do Trombina Autólogo

A fonte da trombina utilizada na medicina regenerativa impacta significativamente a segurança do paciente. Produtos comerciais de trombina são frequentemente derivados de plasma bovino, o que acarreta um risco bem documentado de reações imunológicas. Essas reações não ocorrem apenas pela trombina em si, mas também por impurezas como o fator V bovino, que podem desencadear anticorpos com reatividade cruzada ao fator V humano, resultando em coagulopatias e eventos hemorrágicos potencialmente fatais. Além disso, fontes de trombina bovina ou de plasma humano misto levantam preocupações sobre encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), incluindo a variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD).

Por essas razões, o soro autólogo de trombina, derivado do próprio sangue do paciente, é amplamente reconhecido como a fonte de trombina mais segura. Ele elimina os riscos xenogênicos e alogênicos ao mesmo tempo em que proporciona uma ativação plaquetária altamente eficaz.

Vidro é Fundamental

Ao preparar o ATS, o uso de vidro não é apenas recomendado — é essencial para garantir a ativação adequada da cascata de coagulação. A superfície interna do vidro fornece grupos silicato carregados negativamente que facilitam a iniciação da via intrínseca da coagulação. Essa carga é fundamental para a ativação do fator XII (fator de Hageman), que desencadeia uma cadeia de reações enzimáticas que convertem a protrombina em trombina. O plástico, em contraste, é inerte e carece da carga superficial necessária para iniciar efetivamente a coagulação no PPP sem estímulos bioquímicos adicionais.

Além disso, o vidro aumenta o rendimento de trombina ao fornecer uma superfície estável para a formação do coágulo de fibrina e não introduz substâncias lixiviáveis nem interferência hidrofóbica, como pode ocorrer com certos plásticos. O vidro também melhora a inspeção visual da formação do coágulo, o que é essencial para determinar o tempo de repouso adequado antes da centrifugação. Em resumo, os utensílios de vidro oferecem tanto a atividade superficial bioquímica quanto a transparência física necessárias para uma geração de ATS precisa e eficaz.

Para obter resultados ideais, realize todas as etapas de repouso e coagulação em recipientes de vidro borossilicato ou vidro tipo soda-cal esterilizado. Evite qualquer tipo de revestimento superficial ou forro plástico. Se for necessário transferir o conteúdo para um recipiente plástico após a formação do coágulo, certifique-se de que seja um material certificado para uso médico, com baixa ligação proteica, como o polipropileno ou material similar.

Procedimento para Criar ATS

Materiais Necessários:

• 2,5 mL de plasma pobre em plaquetas (PPP) pré-isolado
• Solução de cloreto de cálcio (CaCl₂) a 10% – estéril, grau USP
• 2 tubos de borossilicato de 4 mL (Vidro é essencial)
• Tampa tipo leur-lock
• 2 seringas de 1 mL
• Agulha 25G
• Agulha 22G
• Válvula de três vias

Instruções:

1. Transfira 2,5 mL de PPP pré-isolado para um tubo de vidro estéril de 4 mL.
2. Aspire 0,25 mL da solução estéril de cloreto de cálcio a 10% do frasco de CaCl₂ usando uma seringa de 1 mL com agulha 25G.
3. Adicione os 0,25 mL da solução de CaCl₂ ao tubo de borossilicato com PPP (mantendo uma proporção de 1:10 CaCl₂:PPP).
4. Inverta ou agite suavemente o tubo para misturar; não agite muito.  
5. Deixe a mistura descansar deitada em temperatura ambiente por 15–30 minutos até que se forme um coágulo de fibrina.
6. Enquanto a mistura repousa, prepare um contrapeso para a centrífuga com outro tubo de vidro de 4 mL contendo 2,75 mL de água.
7. Após o período de repouso, coloque ambos os tubos nos baldes da centrífuga.
8. Centrifugue a 1000g por 5–10 minutos para separar o soro rico em trombina do coágulo de fibrina.
9. Com uma nova seringa de 1 mL e agulha 22G, retire aproximadamente 0,5–0,6 mL do sobrenadante claro (soro autólogo de trombina).
10. Retire a agulha da seringa e fixe uma tampa leur-lock.

Nota: Use imediatamente ou dentro de 2 a 4 horas em temperatura ambiente, sob condições estéreis. Não refrigerar nem congelar. O ATS pode ser transferido para a seringa de PRP preparada usando outra válvula de três vias.

PRP Activation with ATS

1. Misture 5,0 mL de PRP com ~0,5 mL de soro autólogo de trombina fresco usando uma válvula de três vias.
   • Nota: ATS é misturado com PRP na proporção de 1:10 ATS:PRP. A coagulação começa cerca de 20 segundos após a mistura.
2. Usando a válvula de três vias, combine manualmente as duas soluções.
3. Injete ou aplique imediatamente, pois a coagulação se inicia em questão de segundos.
   • Nota: A agulha já deve estar posicionada no local de aplicação, ou considere o uso de um aplicador combinado, como um dispositivo dedicado ou uma válvula de três vias.

Referências

1. Everts, P. A., et al. (2006). “Platelet-rich plasma and platelet gel: a review.” Journal of Extra-Corporeal Technology, 38(2), 174–187.
   – Analisa os mecanismos de ativação plaquetária, incluindo a desgranulação induzida por cloreto de cálcio e o início da cascata de coagulação.
2. Marx, R. E. (2004). “Platelet-rich plasma: evidence to support its use.” Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 62(4), 489–496.
   – Apoia o uso clínico de cloreto de cálcio na criação de trombina autóloga e na adesão tecidual.
3. Takikawa, M., et al. (2011). “Enhanced effect of platelet-rich plasma containing a new carrier on hair growth.” Dermatologic Surgery, 37(12), 1721–1729.
   – Descreve a geração de trombina induzida por cloreto de cálcio em PPP, relevante para a produção de soro enriquecido como o ATS.
4. Drago, L., et al. (2013). “Platelet-rich plasma for the treatment of orthopedic infections: an in vitro study.” PLoS ONE, 8(9), e73863.
   – Demonstra a compatibilidade do cloreto de cálcio com preparações estéreis e injetáveis, afirmando sua utilidade nos fluxos de trabalho com PRP.
5. Mishra, A., et al. (2014). “Platelet-rich plasma in orthopedic applications: evidence-based recommendations for treatment.” Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, 22(18), 469–470.
   - Apresenta recomendações baseadas em evidências para o uso de PRP em lesões musculares e tendíneas, destacando a importância da ativação controlada.
6. Burnouf, T., Strunk, D., Koh, M. B. C., & Schallmoser, K. (2016). “Human platelet lysate: Replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation?” Biologicals, 44(5), 387–400. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2016.01.010
   – Explica os riscos imunológicos associados à trombina bovina e a justificativa para o uso de fontes autólogas.
7. Kumar, V., & Chapman, J. R. (2008). “Autologous Thrombin: Intraoperative Production From Whole Blood.” Techniques in Orthopaedics, 23(2), 116–119. PMCID: PMC4680638
   – Revisa a técnica clínica e a justificativa para a produção de trombina autóloga.