Preparação e Análise de LP-PRP

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DIY PRP
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Introdução

Uma preparação de PRP pobre em leucócitos (LP-PRP) foi realizada utilizando o protocolo do sistema NeutroFree PRP, que consiste na coleta de um grande volume de sangue total e um método de dupla centrifugação, acessando a camada leucoplaquetária após a segunda centrifugação para garantir uma maior recuperação de plaquetas.

Visão Geral do Processo

Process Steps

  1. Coleta de Sangue Total:
    • O anticoagulante ACD-A é utilizado na proporção de 1:9 para a coleta. Duas seringas de 60 mL são preenchidas com 3 mL de anticoagulante ACD-A cada. Para mais informações sobre o ACD-A e sua formulação, leia nosso artigo aqui.
    • Em seguida, 27 mL de sangue total é coletado em cada uma das duas seringas de 60 mL (30 mL de conteúdo em cada).
    • Uma seringa coletou 28 mL de sangue total, e uma amostra basal de 1 mL foi coletada para análise do hemograma.
  2. Primeira Centrifugação:
    • A primeira centrifugação das seringas de 60 mL é realizada a um RCF de 1.250 por 20 minutos, calculado com um Rmax de 155 mm, medido até a superfície do êmbolo interno da seringa. Para a centrífuga utilizada, isso resultou em um RPM de 2.680.
    • Após a primeira centrifugação, a camada de PPP é cuidadosamente aspirada, deixando alguns mL de plasma, garantindo que a camada leucoplaquetária não seja perturbada. Em seguida, uma amostra de 1 mL do PPP aspirado foi coletada para análise do hemograma.
  3. Extração da Camada Leucoplaquetária:
    • Após a aspiração do PPP, a interface entre os eritrócitos e a camada leucoplaquetária permanece intacta e pronta para extração.
    • O PPP restante e a camada leucoplaquetária são então extraídos junto com uma pequena quantidade da camada de eritrócitos (10 mL) em uma nova seringa de 20 mL, garantindo que toda a camada leucoplaquetária e as plaquetas restantes sejam coletadas para a segunda centrifugação.
  4. Segunda Centrifugação:
    • A segunda centrifugação é realizada com uma seringa de 20 mL a um RCF de 380 por 5 minutos, calculado com um Rmax de 142 mm, medido até a superfície do êmbolo interno da seringa. Para a centrífuga utilizada, isso resultou em um RPM de 1.550.
    • Após a segunda centrifugação, a camada de plasma, agora com 5 mL de PRP altamente concentrado, é aspirada, novamente parando antes da interface com os eritrócitos para evitar a diluição e a coleta de granulócitos.
    • Uma amostra de 1 mL dos 5 mL de LP-PRP preparado é coletada para análise do hemograma.
Primeira Centrifugação.
PPP
Aspiração do PPP.
Extração da Camada Leucoplaquetária.
Segunda Centrifugação.
5 mL de PRP Preparado – 1 mL de Amostra

Observações de Hemograma

Observações do PRP

  • Fator de concentração de 6.82x em 5 mL de PRP preparado.
  • Alta recuperação de plaquetas, superior a 56%.
  • Mais de 4,4 bilhões de plaquetas para fornecer terapia eficaz.
  • Redução de eritrócitos em quase 100%.
  • Redução de granulócitos em quase 100%.
  • Leucócitos (granulócitos, linfócitos, monócitos) significativamente reduzidos em mais de 90%.

Observações do PPP

  • Praticamente 100% dos eritrócitos e leucócitos removidos do plasma.
  • O PPP é praticamente desprovido de células.
  • Baixa perda de plaquetas, apenas 8.3%.

Análise da Isolação de Plaquetas

As imagens a seguir demonstram o processo de isolação das plaquetas em relação aos leucócitos. Para gerar as imagens 3 e 4 — que mostram os componentes restantes (hemácias, leucócitos e plasma pobre em plaquetas) — o material residual foi homogeneizado novamente e centrifugado com a mesma força centrífuga relativa (RCF) e tempo utilizados na preparação do PRP. O que podemos observar é que o plasma está isento de plaquetas em suspensão, indicando que elas foram isoladas com sucesso para outra seringa. Isso também confirma que o que permanece na camada leucocitária (buffy coat) são os leucócitos mais densos e, logo abaixo, as hemácias.

1. Segunda centrifugação – PRP antes da aspiração
2. PRP aspirado
3. Hemácias e leucócitos remanescentes após a aspiração do PRP. O plasma está livre de plaquetas.
4. Hemácias e leucócitos remanescentes após a aspiração do PRP. O plasma está livre de plaquetas.
5. Hemácias, leucócitos e plasma pobre em plaquetas (PPP) remanescentes em comparação com o PRP extraído. As plaquetas foram extraídas com sucesso.

Materiais

Os materiais necessários para preparar o Plasma Rico em Plaquetas Pobre em Leucócitos (LP-PRP) variam dependendo de a análise pós-centrifugação (por exemplo, hemograma, contagem celular) ser ou não necessária. Para quem deseja validar suas preparações por meio de análise laboratorial, são necessários suprimentos adicionais, como analisadores hematológicos, tubos a vácuo (vacutainers) e micropipetas. No entanto, para uso clínico direto sem validação laboratorial, o equipamento mínimo necessário é muito mais simples. A lista de itens exigidos cresce substancialmente em configurações mais avançadas, como mostrado abaixo:

Em sua forma mais básica, a preparação de LP-PRP requer apenas o seguinte:

Materiais

  1. Luvas Estéreis
  2. Lenço Estéril
  3. Solução anticoagulante ACD-A
  4. Agulha 25 x 0,70 mm (22G x 1)
  5. Seringa Leur Lock de 60 mL
  6. Seringa Leur Lock de 60 mL
  7. Lenço Estéril
  8. Agulha tipo "butterfly" 20 x 0,80 mm (21G x 0,75")
  9. Torneira de três vias (Three-way stopcock)
  10. Curativo (Band-aid) médio
  11. Gaze estéril
  12. Curativo (Band-aid) pequeno
  13. Tampa Leur Lock
  14. Tampa Leur Lock 
  15. Seringa Leur Lock de 60 mL
  16. Torneira de três vias (Three-way stopcock)
  17. Tampa Leur Lock
  18. Seringa Leur Lock de 10 mL
  19. Tampa Leur Lock
  20. Seringa Leur Lock de 10 mL
  21. Tampa Leur Lock
  22. Conector de transferência Leur Lock para Leur Lock
  23. Seringa Leur Lock de 10 mL
  24. Tampa Leur Lock

Itens extras (não ilustrados):

  1. Torniquete
  2. Tesoura de jardim
  3. Copo com água da torneira (para fazer contrapeso)
  4. Balança
  5. Adaptadores internos para balde da centrífuga
  6. Centrífuga

Recuperação e Quantidade de Plaquetas vs Fator de Concentração

Recuperação e Quantidade de Plaquetas

A porcentagem de plaquetas recuperadas do sangue total e a contagem final de plaquetas do PRP preparado são indicadores mais precisos da eficácia terapêutica e da eficiência de concentração do sistema. O fator de concentração final é um meio pouco confiável para determinar a viabilidade de qualquer sistema de PRP, pois o fator de concentração é determinado pelo volume final, que pode ser facilmente manipulado.

Contagens mais altas de plaquetas nas preparações de PRP demonstraram melhorar a cicatrização de tecidos moles e reduzir os tempos de recuperação em aplicações ortopédicas e de medicina esportiva. Os benefícios terapêuticos do PRP estão diretamente relacionados à quantidade de plaquetas (a dosagem) e à subsequente disponibilidade de fatores de crescimento no local da lesão.

Considerações sobre a Concentração

Os fatores de concentração do PRP são determinados pela quantidade de plaquetas e pelo volume da preparação de PRP. Um volume maior diluirá o fator de concentração final. O volume de PRP preparado é determinado pelo PPP restante após a aspiração da primeira centrifugação. Esta preparação de PRP criou 5 mL de LP-PRP com uma contagem de 4,435 bilhões de plaquetas, levando a um fator de concentração de 6,82x. Possíveis volumes de preparação e fatores de concentração:

  • 5 mL de PRP (4,435 bilhões de plaquetas) = 6.82x
  • 4 mL de PRP (4,435 bilhões de plaquetas) = 8.53x
  • 3 mL de PRP (4,435 bilhões de plaquetas) = 11.37x
  • 2 mL de PRP (4,435 bilhões de plaquetas) = 17.06x
  • 1 mL de PRP (4,435 bilhões de plaquetas) = 34.12x

Como pode ser visto, o fator de concentração pode não ser tão importante quanto a contagem total de plaquetas.

Por que PRP pobre em leucócitos?

A principal função do sistema NeutroFree PRP é criar PRP de alta qualidade pobre em leucócitos (LP-PRP), que é superior para aplicações intra-articulares onde a inflamação é contraproducente. A inflamação pode exacerbar os danos nas articulações e prejudicar o processo de cicatrização. Certos leucócitos, particularmente neutrófilos e macrófagos, liberam citocinas como IL-1 e TNF-α, que contribuem para a inflamação e a degradação da cartilagem nas articulações. Ao reduzir o conteúdo de leucócitos, o LP-PRP minimiza a liberação dessas citocinas inflamatórias, promovendo um ambiente mais favorável à reparação e regeneração dos tecidos. Isso torna o LP-PRP uma escolha ideal para tratar condições articulares, como a osteoartrite, onde controlar a inflamação é crucial para uma cicatrização eficaz.

Benefícios do Sistema NeutroFree PRP

Baixo Custo

Uma métrica interessante a considerar ao avaliar qualquer sistema de concentração de PRP é o custo por bilhão de plaquetas. Uma única preparação de PRP usando este sistema custa aproximadamente R$80 BRL. O PRP preparado tem uma dosagem de 4,435 bilhões de plaquetas, tornando o custo por bilhão de plaquetas R$18,05.

Alta Recuperação de Plaquetas

Devido ao protocolo do sistema e ao uso de seringas, é possível uma recuperação de plaquetas consistentemente alta, superior a 50%.

Coleta Consistente e Precisa de Plaquetas

Evitando o uso de agulhas para a coleta de plaquetas e confiando na precisão dos êmbolos para a seleção uniforme de plaquetas, o sistema NeutroFree PRP é capaz de isolar efetivamente as plaquetas de leucócitos indesejáveis.

Prevenção da Ativação Mecânica das Plaquetas

Concentrando as plaquetas na camada leucoplaquetária e acessando-as após a segunda centrifugação, evitamos a concentração de um pellet de plaquetas que, inadvertidamente, leva à ativação de algumas plaquetas por meio das forças mecânicas da centrifugação.

Imagens adicionais da preparação de LP-PRP

Imagens adicionais demonstrando o desempenho do sistema.

Sangue total coletado
Após a primeira centrifugação
Extração do PPP (plasma pobre em plaquetas)
Sangue total remanescente com camada leucocitária (buffy coat) e PPP extraído
PRP sobrenadante após a segunda centrifugação
PRP extraído
Leucócitos remanescentes após a extração do PRP
PRP extraído

Sangue Total Basal

PRP Pobre em Leucócitos (LP-PRP) – 6.82x

Plasma Pobre em Plaquetas (PPP)

Tabela de Dados

Parâmetro Sangue Total Basal PRP PPP
RBC 3.67 (10^12/L) 0.03 (10^12/L) 0.00 (10^12/L)
HCT 33.8%
MCV 92.1 fl
RDW% 14.7
RDWa 78.7 fl
HGR 10.2 g/dL 0.2 g/dL 0.0 g/dL
MCH 27.8 pg
MCHC 30.2 g/dL
PLT 130 (10^9/L) 887 (10^9/L) 13 (10^9/L)
PCT 0.1% 0.64%
MPV 8.1 fl 7.3 fl
PDW 12.4 fl 11.0 fl
LPCR 19.2% 11.5%
WBC 3.3 (10^9/L) 1.8 (10^9/L) 0.0 (10^9/L)
LYM 1.5 (45%) 1.6 (90.7%)
GRAN 1.5 (44.4%) 0.1 (5.6%)
MTD 0.3 (10.6%) 0.1 (3.7%)
Plaquetas Totais (em 10^9) 7.800 4.435 0.065
Percentual de Recuperação de Plaquetas 56.86%
Redução % RBC 99.93% 100%
Redução % WBC 95.45% 100%
Redução % LYM 91.11% 100%
Redução % GRAN 99.44% 100%
Redução % MTD 97.22% 100%
Porcentagem de Recuperação de WBC 4.55% 0%
Concentração de Plaquetas 6.82x

Referências

  1. Mishra, A., et al. (2014). Platelet-rich plasma in orthopedic applications: evidence-based recommendations for treatment. Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, 22(18), 469-470.
  2. Sundman, E. A., et al. (2014). The anti-inflammatory and matrix restorative mechanisms of platelet-rich plasma in osteoarthritis. American Journal of Sports Medicine, 42(1), 35-41.
  3. Riboh, J. C., et al. (2016). Effect of leukocyte concentration on the efficacy of platelet-rich plasma in the treatment of knee osteoarthritis. American Journal of Sports Medicine, 44(3), 792-800.

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